{"id":13669,"date":"2023-08-11T09:00:00","date_gmt":"2023-08-11T08:00:00","guid":{"rendered":"https:\/\/targetmalaria.org\/?p=13669"},"modified":"2023-08-17T15:20:46","modified_gmt":"2023-08-17T14:20:46","slug":"microinjection-transformation-from-wild-to-genetically-modified-mosquito","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/targetmalaria.org\/fr\/latest\/blog\/microinjection-transformation-from-wild-to-genetically-modified-mosquito\/","title":{"rendered":"Microinjection : Transformation d’un moustique sauvage en un moustique g\u00e9n\u00e9tiquement modifi\u00e9\u00a0"},"content":{"rendered":"\n

\u00c0 Target Malaria, notre travail consiste \u00e0 modifier g\u00e9n\u00e9tiquement des moustiques. Cela nous permet d’acqu\u00e9rir des connaissances pr\u00e9cieuses sur la biologie des moustiques et les m\u00e9canismes de transmission du paludisme, ainsi que de cr\u00e9er des outils potentiels sp\u00e9cifiques aux esp\u00e8ces qui pourraient \u00eatre utilis\u00e9s pour contribuer \u00e0 l’\u00e9limination du paludisme.  <\/p>\n\n\n\n

Le mat\u00e9riel g\u00e9n\u00e9tique ou les \u00ab\u00a0constructions\u00a0\u00bb, con\u00e7us et cr\u00e9\u00e9s en laboratoire pour produire ces modifications, doivent \u00eatre physiquement introduits dans le moustique, o\u00f9 nous pouvons ensuite en analyser les effets.  <\/p>\n\n\n\n

On nous demande souvent comment nous modifions les moustiques. Dans ce blog, je d\u00e9cris ce processus – la micro-injection. <\/p>\n\n\n\n

\"Photo<\/figure>\n\n\n\n

Photo du moustique Anopheles gambiae<\/em>, principal vecteur du paludisme\u00a0<\/em><\/sub><\/p>\n\n\n\n

Une fois le m\u00e9lange d’injection pr\u00e9par\u00e9, une solution liquide contenant des copies du mat\u00e9riel g\u00e9n\u00e9tique, il doit \u00eatre conserv\u00e9 au frais sur de la glace. Les \u0153ufs de moustiques sont ensuite n\u00e9cessaires pour l’\u00e9tape suivante.   <\/p>\n\n\n\n

Pour produire des \u0153ufs, les femelles ont besoin de nutriments provenant d’un repas sanguin, qui leur est fourni par un syst\u00e8me de gavage artificiel quelques jours auparavant. Comme les moustiques pondent leurs \u0153ufs sur l’eau pendant la nuit, ces conditions sont imit\u00e9es en pla\u00e7ant leur cage dans l’obscurit\u00e9 avec un plat de papier mouill\u00e9. Au bout de 15 minutes, il y a g\u00e9n\u00e9ralement suffisamment d’\u0153ufs pondus pour commencer.  <\/p>\n\n\n\n

Bien que ces \u0153ufs soient g\u00e9n\u00e9ralement appel\u00e9s \u00ab\u00a0\u0153ufs\u00a0\u00bb, il s’agit plus pr\u00e9cis\u00e9ment d'\u00a0\u00bbembryons\u00a0\u00bb, car les femelles se sont d\u00e9j\u00e0 accoupl\u00e9es avec un m\u00e2le et les \u0153ufs ont \u00e9t\u00e9 f\u00e9cond\u00e9s, chaque embryon commen\u00e7ant d\u00e9j\u00e0 \u00e0 se d\u00e9velopper en une petite larve \u00e0 l’int\u00e9rieur de sa coquille.  <\/p>\n\n\n\n

Une fois la ponte effectu\u00e9e, la fen\u00eatre d’injection est limit\u00e9e \u00e0 moins d’une heure ! Si vous \u00eates trop t\u00f4t, les embryons sont trop mous et d\u00e9licats, et si vous \u00eates trop tard, ils deviennent fermes et pressuris\u00e9s \u00e0 l’int\u00e9rieur. La couleur des embryons est un bon indicateur : fra\u00eechement pondus, ils sont blanc-jaune p\u00e2le et s’assombrissent avec le temps \u00e0 mesure qu’ils d\u00e9veloppent des pigments ; la couleur interm\u00e9diaire gris clair est donc id\u00e9ale.  <\/p>\n\n\n\n

Pour que les embryons restent hydrat\u00e9s et en place pendant l’injection, un st\u00e9r\u00e9omicroscope (un microscope \u00e0 deux yeux qui permet d’obtenir une image en 3D par rapport \u00e0 un microscope conventionnel \u00e0 un \u0153il) et un pinceau sont utilis\u00e9s pour les aligner soigneusement sur une lame de microscope en verre contre un papier nitrocellulose fin, avec un papier filtre humide plus \u00e9pais par-dessus. Le positionnement de l’embryon et la section sp\u00e9cifique \u00e0 injecter sont des facteurs cruciaux pour assurer un acc\u00e8s facile \u00e0 l’aiguille.  <\/p>\n\n\n\n

Les embryons de moustiques et d’autres insectes commencent avec de nombreuses copies de leur mat\u00e9riel g\u00e9n\u00e9tique sous forme de \u00ab\u00a0noyaux\u00a0\u00bb \u00e0 l’int\u00e9rieur d’une seule cellule, qui sont ensuite compartiment\u00e9s en cellules individuelles. En th\u00e9orie, n’importe quel noyau\/cellule peut \u00eatre modifi\u00e9, mais ce ne sont que ceux qui forment les cellules reproductrices de la \u00ab\u00a0lign\u00e9e germinale\u00a0\u00bb – c’est-\u00e0-dire, si l’embryon est une femelle, leurs futurs \u0153ufs, ou si c’est un m\u00e2le, leurs futurs spermatozo\u00efdes – qui subiront les modifications dans leur prog\u00e9niture, transmises \u00e0 la g\u00e9n\u00e9ration suivante, et \u00e0 la suivante… Ces noyaux sont situ\u00e9s \u00e0 l’extr\u00e9mit\u00e9 post\u00e9rieure (arri\u00e8re) de l’embryon, qui peut \u00eatre identifi\u00e9e par son aspect l\u00e9g\u00e8rement plus mince et plus pointu que l’extr\u00e9mit\u00e9 ant\u00e9rieure (avant), o\u00f9 se forme la t\u00eate. L’embryon est donc plac\u00e9 avec l’extr\u00e9mit\u00e9 post\u00e9rieure en haut. <\/p>\n\n\n\n

\"Embryos<\/figure>\n\n\n\n

Les embryons sont transf\u00e9r\u00e9s en position contre un papier fin \u00e0 l’aide d’un pinceau.<\/em>\u00a0<\/sub><\/p>\n\n\n\n

Une fois align\u00e9s (~30-50 par lame), les embryons sont plac\u00e9s sous un microscope invers\u00e9 (o\u00f9 la lumi\u00e8re vient du haut et les lentilles du bas, \u00e0 l’inverse d’un microscope conventionnel) qui permet une visualisation facile.  <\/p>\n\n\n\n

Les \u0153ufs \u00e9tant si petits (environ un demi-millim\u00e8tre), il serait impossible de les injecter \u00e0 la main. C’est pourquoi un \u00e9quipement sp\u00e9cialis\u00e9 est utilis\u00e9 pour contr\u00f4ler les mouvements pr\u00e9cis d’une aiguille et l’\u00e9coulement du m\u00e9lange \u00e0 injecter.  <\/p>\n\n\n\n

Une aiguille tr\u00e8s fine en verre de quartz, \u00e9galement fabriqu\u00e9e dans le laboratoire, est charg\u00e9e du m\u00e9lange d’injection et fix\u00e9e dans un support, avec une pression d’air fournie par des tubes et une pompe \u00e0 l’arri\u00e8re pour contr\u00f4ler le flux de liquide. Les mouvements de l’aiguille sont command\u00e9s par un joystick et la pression d’injection est contr\u00f4l\u00e9e par un bo\u00eetier de commande informatique et une souris. En cliquant sur un bouton, le m\u00e9lange est inject\u00e9, ce qui se traduit par un l\u00e9ger mouvement du contenu \u00e0 l’int\u00e9rieur de l’embryon.<\/p>\n\n\n\n

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\"Loading<\/figure>\n<\/div>\n\n\n\n
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\"Microinjecting<\/figure>\n<\/div>\n<\/div>\n\n\n\n
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Chargement de l’aiguille de micro-injection avec le m\u00e9lange<\/em><\/em>\u00a0<\/sub><\/p>\n<\/div>\n\n\n\n

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Micro-injection des embryons<\/em>\u00a0<\/p>\n<\/div>\n<\/div>\n\n\n\n

Une grande attention est n\u00e9cessaire pour que les embryons re\u00e7oivent suffisamment de solution pour introduire le mat\u00e9riel g\u00e9n\u00e9tique au bon endroit sans causer de dommages. Il s’agit d’une comp\u00e9tence sp\u00e9cifique dont l’apprentissage peut prendre un certain temps.<\/p>\n\n\n\n

\"Embryos<\/figure>\n\n\n\n

Injection d’embryons<\/em>\u00a0<\/sub><\/p>\n\n\n\n

Apr\u00e8s l’injection, les embryons sont plac\u00e9s dans un pot d’eau entour\u00e9 de papier mouill\u00e9. Au cours des deux jours suivants, ils se transforment en larves et commencent \u00e0 \u00e9clore en se tortillant dans l’eau.  <\/p>\n\n\n\n

Comme les modifications ne sont pas visibles, nous incluons \u00e9galement un g\u00e8ne qui produit une prot\u00e9ine fluorescente qui brille sous un microscope avec une lumi\u00e8re laser \u00e0 une longueur d’onde sp\u00e9cifique. Cette fluorescence agit comme un \u00ab\u00a0marqueur\u00a0\u00bb et permet de suivre les modifications g\u00e9n\u00e9tiques.  <\/p>\n\n\n\n

Lorsque les embryons inject\u00e9s \u00e9closent sous forme de larves, ils peuvent pr\u00e9senter une expression \u00ab\u00a0transitoire\u00a0\u00bb de ce marqueur au site d’injection, ce qui indique que l’injection a r\u00e9ussi. <\/p>\n\n\n\n

\"Injected<\/figure>\n\n\n\n

Le moustique inject\u00e9 a \u00e9clos sous la forme d’une larve pr\u00e9sentant une expression transitoire.<\/em>\u00a0<\/sub><\/p>\n\n\n\n

Comme indiqu\u00e9, le mat\u00e9riel g\u00e9n\u00e9tique doit non seulement \u00eatre pr\u00e9sent, mais aussi int\u00e9gr\u00e9 dans les cellules germinales pour \u00eatre transmis \u00e0 la g\u00e9n\u00e9ration suivante. Ainsi, une fois adultes, les moustiques inject\u00e9s sont tous crois\u00e9s avec des moustiques du sexe oppos\u00e9 (normalement des types sauvages pour maximiser le nombre) et leur prog\u00e9niture est examin\u00e9e pour d\u00e9tecter ceux qui sont \u00ab\u00a0transg\u00e9niques\u00a0\u00bb, c’est-\u00e0-dire qui ont enti\u00e8rement h\u00e9rit\u00e9 des modifications.\u00a0\u00a0<\/p>\n\n\n\n

\"Offspring<\/figure>\n\n\n\n

Prog\u00e9niture de moustiques inject\u00e9s pr\u00e9sentant une expression transg\u00e9nique<\/em>\u00a0<\/sub><\/p>\n\n\n\n

Les transg\u00e9niques sont contr\u00f4l\u00e9s mol\u00e9culairement en laboratoire pour s’assurer que le mat\u00e9riel g\u00e9n\u00e9tique s’est int\u00e9gr\u00e9 comme pr\u00e9vu. L’\u00e9tude des effets des modifications peut alors commencer…\u00a0<\/p>\n\n\n\n

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